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如何測定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的載體拷貝數(shù)(VCN)

更新時(shí)間:2024-07-28  |  點(diǎn)擊率:570

在基因治療和細(xì)胞療法中,特別是CAR-T細(xì)胞療法和TCR-T細(xì)胞療法,載體拷貝數(shù)(Vector Copy Number, VCN)是一個(gè)至關(guān)重要的參數(shù)。它直接關(guān)系到細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性和有效性。VCN指的是外源基因載體整合到宿主細(xì)胞基因組中的拷貝數(shù),過高的VCN可能會(huì)增加致癌風(fēng)險(xiǎn),而過低的VCN則可能影響基因表達(dá)效率。因此,準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的VCN對于細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用具有重要意義。本文將詳細(xì)介紹幾種常用的測定VCN的方法及其優(yōu)缺點(diǎn)。

常用的VCN測定方法

1. 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR

定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)是目前測定VCN常用的方法之一。該方法通過提取轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因組DNAgDNA)作為模板,設(shè)計(jì)特異性引物和探針,針對目的基因和參考基因(通常為單拷貝基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或絕對定量法,可以計(jì)算出每單位DNA中目的基因的拷貝數(shù),進(jìn)而推算出每個(gè)細(xì)胞中的載體拷貝數(shù)。

優(yōu)點(diǎn):

  • 靈敏度高,能夠檢測到極低的拷貝數(shù)。

  • 操作簡便,成本相對較低。

  • 可用于大規(guī)模樣本的檢測。

缺點(diǎn):

  • 需要生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,且標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性直接影響結(jié)果。

  • 精度較低,特別是在低拷貝數(shù)情況下。

  • 可能存在競爭性抑制問題,影響多重PCR的準(zhǔn)確性。

2. 數(shù)字PCRdPCR

數(shù)字PCR是一種絕對定量的PCR方法,它將含有目標(biāo)序列的反應(yīng)溶液分配到大量獨(dú)立的反應(yīng)室中,每個(gè)反應(yīng)室只包含少量模板DNA分子。通過PCR擴(kuò)增后,計(jì)算陽性反應(yīng)室的比例,并根據(jù)泊松分布進(jìn)行校正,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸序列的絕對定量。

優(yōu)點(diǎn):

  • 不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

  • 靈敏度和精度均高于qPCR,特別是在低拷貝數(shù)情況下。

  • 可用于多重檢測,減少操作誤差。

缺點(diǎn):

  • 成本較高,設(shè)備昂貴。

  • 操作復(fù)雜,對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。

3. Tapestri® VCN Assay

Tapestri® VCN Assay是近年來推出的一種高通量單細(xì)胞檢測方法,能夠在單個(gè)細(xì)胞水平上對VCN進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該方法結(jié)合了單細(xì)胞DNA分析和多組學(xué)技術(shù),能夠在一次檢測中同時(shí)獲取數(shù)千個(gè)單個(gè)工程化改造后細(xì)胞內(nèi)的VCN和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率信息。

優(yōu)點(diǎn):

  • 高通量,能夠在單個(gè)細(xì)胞水平上進(jìn)行檢測。

  • 準(zhǔn)確度高,能夠揭示細(xì)胞間的VCN差異。

  • 可縮短表征周期,減少樣本用量。

缺點(diǎn):

  • 技術(shù)較新,普及程度不高。

  • 設(shè)備昂貴,操作復(fù)雜。

實(shí)驗(yàn)步驟與注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 樣本準(zhǔn)備:收集轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞,提取基因組DNA。

  2. 引物與探針設(shè)計(jì):根據(jù)目的基因和參考基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針。

  3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建(如采用qPCR方法):將編碼目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)稀釋,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  4. PCR擴(kuò)增:根據(jù)所選方法(qPCR、dPCRTapestri® VCN Assay)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

  5. 數(shù)據(jù)分析:根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算VCN

注意事項(xiàng)

  1. 樣本質(zhì)量:確保提取的基因組DNA質(zhì)量良好,無降解和污染。

  2. 引物與探針設(shè)計(jì):引物和探針應(yīng)具有高度的特異性和敏感性,避免非特異性擴(kuò)增。

  3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建:標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性對結(jié)果影響重大,需嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。

  4. 操作規(guī)范:嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行,避免操作誤差。

結(jié)論

準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的載體拷貝數(shù)(VCN)對于細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用具有重要意義。目前常用的測定方法包括qPCRdPCR等,每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)具體需求和實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的方法,并嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,未來可能會(huì)有更多更準(zhǔn)確、更便捷的方法出現(xiàn),為細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供有力支持。


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