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細(xì)胞凍存『掃雷指南』,這些關(guān)鍵點(diǎn)必看!

更新時(shí)間:2022-12-26  |  點(diǎn)擊率:765

細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)常規(guī)步驟,是細(xì)胞保存的重要方法之一。將細(xì)胞低溫保存在-196℃液氮中,使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而進(jìn)入休眠階段,以便日后復(fù)蘇重新培養(yǎng)擴(kuò)增。

細(xì)胞凍存方法

細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn),在往期文章中也有提到

保姆級(jí)細(xì)胞凍存方法

看似簡單的實(shí)驗(yàn),仍有一些關(guān)鍵點(diǎn)需要格外留意,切莫踩到“雷區(qū)",造成“實(shí)驗(yàn)大翻車"。

凍存操作前:

選擇長勢良好、存活率高,且生長密度在80%—90%的細(xì)胞進(jìn)行凍存。

需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雜質(zhì)檢測:是否有雜細(xì)胞或者支原體等雜質(zhì)。

這里推薦使用MB支原體常規(guī)法PCR檢測試劑盒,非定量檢測,常規(guī)PCR即可滿足需求,方便快捷,靈敏度高。

所用凍存試劑DMSO應(yīng)為分析級(jí),避光儲(chǔ)存。

凍存前一日,對(duì)需保存的細(xì)胞進(jìn)行換液處理。

凍存操作

配制凍存培養(yǎng)基(常規(guī)含量):DMSO含量5-10%,血清含量20%左右。

用凍存培養(yǎng)基將離心后的細(xì)胞進(jìn)行重懸。

分裝至無菌凍存管中。

梯度降溫:

4℃ 10 分鐘

?

-20℃ 30 分鐘

?

-80℃ 16~18 小時(shí)

?

液氮

或?qū)⒀b有細(xì)胞的凍存管,置于程序降溫盒中,放入-80℃冰箱中,一天后轉(zhuǎn)移至液氮中。

液氮的液相儲(chǔ)存與氣相儲(chǔ)存

一般認(rèn)為:-196℃的液氮,對(duì)于需要長期保存的細(xì)胞而言,是一比較合適的環(huán)境。因此,我們會(huì)將裝有細(xì)胞的凍存管,放入專用的方形凍存盒中,再裝進(jìn)液氮罐配套的提籃提籃中,浸入液氮的液相中進(jìn)行保存。

但在液相中長期儲(chǔ)存,容易面臨以下問題:

如果凍存管在罐內(nèi)密封不嚴(yán),則會(huì)引起液氮滲入管內(nèi),灌滿整個(gè)樣品管,造成樣品的污染。不僅如此,在取出凍存管的時(shí)候,液氮沸騰氣化使管內(nèi)氣壓升高,發(fā)生炸裂,容易傷到實(shí)驗(yàn)人員。

因此,有人提出,可以將細(xì)胞置于液氮的氣相中進(jìn)行儲(chǔ)存。

液氮罐內(nèi)溫度較比液相儲(chǔ)存高,一般在-135℃至-190℃,對(duì)于細(xì)胞儲(chǔ)存而言,該溫度也符合要求,但在實(shí)際操作過程中,也存在一定弊端:

與液相液氮罐相比,氣相液氮罐,在相同體積的液氮中保存時(shí)間更短,需對(duì)液氮罐內(nèi)的溫度進(jìn)行監(jiān)控,及時(shí)補(bǔ)充液氮來維持罐內(nèi)溫度。

所以,應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)條件等情況,合理選擇液相儲(chǔ)存或是氣相儲(chǔ)存。在正確操作的前提下,這兩者都能達(dá)到比較好的凍存效果


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