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您了解核酸法驗證中支原體標準品嗎?

更新時間:2023-05-05  |  點擊率:511

什么是支原體核酸法

支原體核酸法包括PCR和qPCR,通過檢測支原體的特異核酸序列,以確定細胞上清或生物制品中是否存在支原體污染的一種方法。

由于支原體核酸法具有檢測時間短(只需3-4h)、操作便捷等特點,越來越受到生物制品企業(yè)的青睞。

支原體核酸法可作為藥典規(guī)定的培養(yǎng)法或DNA染色法的替代方法,或與以上方法相互補充。

事實上,早在2011年,就有動物疫苗廠家在2011年第5期的《廣東農業(yè)科學》上,報道了用德國Minerva Biolabs(簡稱MB)公司的支原體PCR試劑盒,用于檢測疫苗中是否存在支原體的污染,它可與培養(yǎng)法互為補充,共同用于生產,為生產提供可靠的數據支持。

支原體標準品

方法驗證

支原體核酸法在用于放行檢測之前,需先進行方法驗證。歐洲藥典和日本藥典均要求核酸法需要在靈敏度、特異性和耐用性三個指標方面達到要求。

在靈敏度方面(又稱最di檢測限),要求核酸法替代培養(yǎng)法,則靈敏度需達到10CFU/ml;核酸法替代DNA染色法,則靈敏度需達到100CFU/ml。


在特異性方面,歐洲藥典和日本藥典要求,核酸法要識別指ding的常見9種支原體,而不識別與支原體有近緣關系的菌屬,如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳桿菌和肺炎鏈球菌,也不識別其他細菌和哺乳動物DNA。

在耐用性方面,歐洲藥典要求檢測結果不受方法參數的小的偏差的影響,如濃度的變化(MgCl2、引物、dNTP)、提取步驟的細微差別等。實際上這是強調結果的可靠性和穩(wěn)定性,不受人為操作誤差的影響。這可通過3輪不同時間段內的檢測來實現(xiàn),每輪進行8次重復檢測,最后觀察結果有什么變化。

在進行方法驗證時,參比標準品是bi不可少的。著名微生物防控專家德國MB公司提供有一系列的支原體標準品和支原體DNA標準品,用于支原體核酸法的方法學驗證。

支原體標準品

Minerva Biolabs標準品

MB提供的標準品有三類:

靈敏度標準品

同時也用于耐用性驗證。該標準品為凍干粉型的滅活支原體,這樣不會造成實驗室污染。原支原體來自英國NCTC菌種保藏中心,由于傳代次數低,也很少發(fā)生突變。支原體經標準定量,有10CFU/管和100CFU/管可選。使用時用1ml與待測樣本同樣的基質液去溶解。之后進行支原體DNA抽提,再進行核酸法檢測。如結果陽性,則表明最di檢測限能達到上述標準。

特異性驗證用標準品

它包括支原體基因組DNA以及細菌基因組DNA,種屬經測序驗證。該標準品為10ng左右包裝,為凍干粉型。用于PCR和qPCR方法對支原體物種的特異性檢查,每種支原體DNA經測序驗證,濃度經滴度測定。


PCR定量標準品

該標準品是經過嚴格定量的支原體DNA標準品,每管支原體基因組DNA的量為1×10^8基因組拷貝,用于10倍梯度稀釋制備標準曲線,以對核酸法(主要是qPCR)的檢測限進行精確定量,并可驗證標準品濃度對數與Ct值的線性關系。

值得指出的是,歐洲藥典和日本藥典均要求先進行支原體DNA抽提,再進行核酸法檢測。因此,方法驗證實際上包括了核酸法的這兩部分。

對于生物制品、細胞治療產品的生產企業(yè),在選用已經過廠家全面驗證的支原體檢測試劑盒之外,還需自己按照待測樣本類型進行方法的適用性驗證。

試劑盒的驗證并不能代替包括操作過程在內的方法的適用性,操作、樣本基質和儀器同樣會對核酸法的技術指標產生不可忽視的影響。因此“對癥下藥"就顯得尤為重要了。



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