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PCR試劑盒靈敏度與方法驗(yàn)證概說

更新時(shí)間:2020-11-16  |  點(diǎn)擊率:1239

PCR方法已廣泛用于科研,在工業(yè)中也有不斷擴(kuò)大應(yīng)用的趨勢,它包括檢測一些病原體、檢測支原體污染、檢測細(xì)菌污染以及檢測殘留宿主DNA等。

 

PCR在工業(yè)中的應(yīng)用主要存在一個(gè)方法驗(yàn)證的問題,尤其是靈敏度的驗(yàn)證。靈敏度不夠,就會發(fā)生漏檢。另外,PCR所直接面對的樣本是DNA,而非病原菌或DNA,因此還需要做DNA抽提,這也是要注意的。

 

下面以支原體PCR檢測為例,略說說靈敏度的驗(yàn)證。

 

藥典規(guī)定,生物藥廠的主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、生產(chǎn)終末細(xì)胞、檢定細(xì)胞、病毒種子批和病毒收獲液、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料如培養(yǎng)基、胰酶、臨床治療用干細(xì)胞和免疫細(xì)胞等,都必須不含支原體。

因此,如能采用PCR檢測支原體并替代藥典方法,還是能節(jié)省很多時(shí)間和精力。但PCR方法的驗(yàn)證需要較為全面。靈敏度驗(yàn)證是一個(gè)重要方面。靈敏度不夠,就會發(fā)生漏檢?!稓W洲藥典》第2.6.7章(EP 2.6.7)和《日本藥典》第17版第G3章(JP G3),都規(guī)定,對于核酸擴(kuò)增法(如PCR)檢測支原體,如替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法,都要求檢測限達(dá)到10 CFU/ml。

 

具體驗(yàn)證可使用10CFU的支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品,它一般為凍干粉形式,需要用待測樣本的樣本基質(zhì)(需保證里面不含支原體)來復(fù)溶,再進(jìn)行DNA抽提以及PCR檢測。如檢測的電泳有條帶,或者qPCR檢測后的Ct值小于40,即表明檢測成功。

 

因此,在選用支原體PCR法檢測來替代藥典方法時(shí),需要考慮如下兩個(gè)方面:

 

第yi步是要使用符合歐洲藥典要求,經(jīng)過全面驗(yàn)證的支原體檢測試劑盒,第二部是自我驗(yàn)證,即確認(rèn)所用的樣本基質(zhì)對于該試劑盒方法是合適的,并且操作過程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗(yàn)證通常需要采用三個(gè)不同批次的試劑盒,然后加入10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品,做復(fù)孔(通常是8個(gè)復(fù)孔),并且至少選擇3個(gè)支原體物種進(jìn)行驗(yàn)證。

 

有的支原體標(biāo)準(zhǔn)品廠家會提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值,以方便二者的換算。因?yàn)?/span>10CFU只能確定PCR能夠達(dá)到的檢測限在10CFU以下,但無法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進(jìn)一步確定檢測限的數(shù)值。

 

總之,PCR方法很有用,但需要避免假陰性,驗(yàn)證時(shí)應(yīng)使用陽性對照、陰性對照、無模板對照和內(nèi)控對照,以保證PCR反應(yīng)正常,以及支原體少量存在時(shí)確實(shí)能檢出來,支原體不存在時(shí)也確保是結(jié)果陰性,從而使得PCR方法在工業(yè)應(yīng)用時(shí)能確保終結(jié)果的可靠。

 

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