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PCR試劑盒靈敏度與方法驗證概說

更新時間:2020-11-16  |  點擊率:1240

PCR方法已廣泛用于科研,在工業(yè)中也有不斷擴大應用的趨勢,它包括檢測一些病原體、檢測支原體污染、檢測細菌污染以及檢測殘留宿主DNA等。

 

PCR在工業(yè)中的應用主要存在一個方法驗證的問題,尤其是靈敏度的驗證。靈敏度不夠,就會發(fā)生漏檢。另外,PCR所直接面對的樣本是DNA,而非病原菌或DNA,因此還需要做DNA抽提,這也是要注意的。

 

下面以支原體PCR檢測為例,略說說靈敏度的驗證。

 

藥典規(guī)定,生物藥廠的主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞、檢定細胞、病毒種子批和病毒收獲液、細胞培養(yǎng)相關(guān)材料如培養(yǎng)基、胰酶、臨床治療用干細胞和免疫細胞等,都必須不含支原體。

因此,如能采用PCR檢測支原體并替代藥典方法,還是能節(jié)省很多時間和精力。但PCR方法的驗證需要較為全面。靈敏度驗證是一個重要方面。靈敏度不夠,就會發(fā)生漏檢?!稓W洲藥典》第2.6.7章(EP 2.6.7)和《日本藥典》第17版第G3章(JP G3),都規(guī)定,對于核酸擴增法(如PCR)檢測支原體,如替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法,都要求檢測限達到10 CFU/ml

 

具體驗證可使用10CFU的支原體靈敏度標準品,它一般為凍干粉形式,需要用待測樣本的樣本基質(zhì)(需保證里面不含支原體)來復溶,再進行DNA抽提以及PCR檢測。如檢測的電泳有條帶,或者qPCR檢測后的Ct值小于40,即表明檢測成功。

 

因此,在選用支原體PCR法檢測來替代藥典方法時,需要考慮如下兩個方面:

 

第yi步是要使用符合歐洲藥典要求,經(jīng)過全面驗證的支原體檢測試劑盒,第二部是自我驗證,即確認所用的樣本基質(zhì)對于該試劑盒方法是合適的,并且操作過程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗證通常需要采用三個不同批次的試劑盒,然后加入10CFU的標準品,做復孔(通常是8個復孔),并且至少選擇3個支原體物種進行驗證。

 

有的支原體標準品廠家會提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值,以方便二者的換算。因為10CFU只能確定PCR能夠達到的檢測限在10CFU以下,但無法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標定的基因組DNA標準品則可進一步確定檢測限的數(shù)值。

 

總之,PCR方法很有用,但需要避免假陰性,驗證時應使用陽性對照、陰性對照、無模板對照和內(nèi)控對照,以保證PCR反應正常,以及支原體少量存在時確實能檢出來,支原體不存在時也確保是結(jié)果陰性,從而使得PCR方法在工業(yè)應用時能確保終結(jié)果的可靠。

 

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